Στη μοριακή βιολογία, η καλή επιλογή του ρυθμιστή και η προετοιμασία για διαφορετικά βήματα απομόνωσης DNA μπορεί να είναι η διαφορά μεταξύ της μετάβασης στην έκφραση της πρωτεΐνης ή του ανοίγματος ενός άλλου maxi-prep kit για να ξεκινήσει πάλι. Παρά την αποφασιστική σημασία τους, οι συνταγές μνήμης είναι συχνά αυτές που συνταγμένες χωρίς εξήγηση ή αιτιολογία για τα διάφορα συστατικά. Ένα τέτοιο ρυθμιστικό διάλυμα είναι ρυθμιστικό διάλυμα γλυκόζης-τρις-ΕϋΤΑ ή GTE.
$config[code] not foundΓιατί χρησιμοποιείται το GTE;
Το GTE χρησιμοποιείται για την επαναιώρηση των βακτηριακών κυτταρικών σφαιριδίων πριν από τη λύση (διάσπαση των κυττάρων) και τη συλλογή του πλασμιδιακού DNA στο εσωτερικό του. Η λυσοζύμη, η οποία μαλακώνει τις κυτταρικές μεμβράνες, συχνά προστίθεται μαζί με το ρυθμιστικό GTE. Η επίτευξη ενός ομοιογενούς εναιωρήματος ολόκληρων κυττάρων κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος, έτσι ώστε το μεταγενέστερα προστιθέμενο διάλυμα λύσης να μπορεί να φτάσει σε όλα τα κύτταρα είναι το κλειδί για την επίτευξη καλών αποδόσεων DNA. Το GTE έχει σχεδιαστεί για να το κάνει αυτό, παρέχοντας ταυτόχρονα ένα σταθερό περιβάλλον για το DNA.
Γλυκόζη για οσμωτικότητα
50mM (millimolar) σακχάρου γλυκόζης προστίθεται στο ρυθμιστικό GTE για να διατηρηθεί η οσμωμοριακότητα όπου η συγκέντρωση της διαλελυμένης ουσίας εκτός των κυττάρων είναι κοντά σε εκείνη εντός των κυττάρων. Αυτό αποτρέπει την πρόωρη λύση των κυττάρων, η οποία μπορεί να προκαλέσει χαμηλότερες αποδόσεις DNA λόγω συσσωμάτωσης και υποβάθμισης. Τα άλλα συστατικά του ρυθμιστικού διαλύματος συμβάλλουν επίσης στην οσμωτικότητα του διαλύματος, αλλά η γλυκόζη, που είναι μη ηλεκτρολύτης, είναι μια καλή επιλογή επειδή δεν παρεμβαίνει στις ιδιότητες του ρυθμιστικού διαλύματος.
Tris για σταθερότητα ρΗ
Το Tris είναι η σύντομη ονομασία για το τρις (υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο, το οποίο είναι ένα πολύ κοινό ρυθμιστικό ρΗ. Στην περίπτωση ρυθμιστικού GTE, το όξινο άλας (Τπδ-ΗΟΙ) προστίθεται στο ρυθμιστικό διάλυμα σε συγκέντρωση 25 mM. Αυτό διατηρεί το ρΗ του διαλύματος σε ένα σχεδόν φυσιολογικό 8,0, ένα ιδανικό ρΗ για την πρόληψη της όξινης υδρόλυσης (αποικοδόμηση) του πλασμιδικού ϋΝΑ και των ανεπιθύμητων παρενεργειών των άλλων κυτταρικών συστατικών.
Το EDTA προλαμβάνει την υποβάθμιση του DNA
Το ΕϋΤΑ ή το αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ συλλαμβάνει ή εξαλείφει ιόντα μετάλλων από το διάλυμα, εμποδίζοντας τους να συμμετέχουν σε ανεπιθύμητες παρενέργειες. Σε ρυθμιστικό GTE, προστίθεται EDTA στα 10 mM. Ο πρωταρχικός σκοπός του είναι στο ρυθμιστικό διάλυμα να στρογγυλεύσει ελεύθερο ψευδάργυρο, μαγνήσιο και ασβέστιο, εμποδίζοντας έτσι την αποικοδόμηση του DNA από ορισμένες οδούς που απαιτούν αυτά τα μέταλλα.
Ορισμένες σημαντικές συμβουλές
Κρατήστε το ρυθμιστικό σας GTE κρύο και το κάνετε σε μικρές ποσότητες για να αποτρέψετε την ανάπτυξη ακούσιων βακτηρίων σε αυτό. Η ζάχαρη και το ελεγχόμενο pH δημιουργούν ένα μεγάλο μέσο ανάπτυξης. Χρησιμοποιείτε πάντα καθαρό νερό. Το νερό της βρύσης μπορεί να έχει περίσσεια μεταλλικών ιόντων από τους σωλήνες, τα οποία μπορούν να συντρίψουν την ικανότητα του EDTA να συλλάβει. Εάν υποψιάζεστε την παρουσία παρεμβαλλόμενου RNA στο δείγμα σας, προσθέστε RNase A στα 100 μικρογραμμάρια ανά χιλιοστόλιτρο στο GTE buffer για να εξαλείψετε το πρόβλημα.
